특정기초연구

양식 115a

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〈 연 구 내 용 〉

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1. 연구배경 및 중요성 (Background and Significance)

가. 연구배경

본 연구는 신규 유산균의 세포외 다당류(exopolysacchrides, EPS)의 종합적 분리분석법 개발과 그 활용에 관한 연구이다.

다당류의 정성 및 정량 분리분석은 매우 까다롭고 도전적인 연구분야이다. 유산균의 세포외 다당류(exopolysaccharides, EPS)의 분석에는 배지 내 함량 결정, 정제된 다당류의 평균분자량 측정, 분자량 분포 분석, 다당류 구성 단당류 조성 규명, 다당류의 반복단위 결정, 다당류의 conformation과 입체적 구조 분석 등이 포함된다.

평균분자량의 측정에는 점도측정법 등이 전통적으로 사용되어 왔으며 유산균의 세포외 다당류는 분자량의 범위가 1.0X10⁴에서 6.0X10⁶사이인 것으로 알려져 있다(Cerning, 1995). 배지에서 분리된 다당류의 분자량 분포에 대한 연구는 거의 보고된 바 없으며 본 연구에서는 이에 대한 체계적인 연구를 수행할 것이다.

다당류 구성 단당류 조성을 규명하려면 다당류를 완전가수분해 한 후 methylation이나 silylation 등 유도체화 반응으로 휘발성을 증가시키고 GC/MS(Kamerling, 1989, Chaplin, 1982)로 분석하는 방법이 보편적이다. 유산균의 다당류 구성 단당류 분석에서는 사용된 바 없으나, 다른 시료의 단당류 분석에서 많이 쓰이는 방법으로서 pulsed amperometric detector(PAD)를 지닌 음이온교환 크로마토그래피로 분석하는 방법도 알려져 있다(Sullivan, 1994, Marko-Varga, 1994). 본 연구에서는 이 두 가지 방법과 함께 새롭게 CE 및 CE/MS 또는 CEC/MS 분석법을 개발하고 활용하여 그 분석결과를 비교하는 연구를 하고자 한다.

다당류의 반복단위 결정은 정제된 다당류 및 그 부분가수분해 산물인 올리고당의 NMR 스펙트럼과 휘발성 유도체의 GC/MS 스펙트럼을 종합적으로 분석함으로써(Leeflang,2000, Robijn,1996, Fox,1999) 수행할 수 있으나 상황에 따라서는 다당류가 여러 다른 종류가 섞여 있을 수도 있으므로(De Vuyst, 2001 및 그 인용문헌) 다당류 또는 부분가수분해 산물인 올리고당 시료를 Prep GPC를 활용하여 fraction 별로 분리하여 분석할 필요가 있다. 다당류의 conformation과 입체구조는 그 학문적, 산업적 중요성이 강조되는 반면 실제적인 연구는 전세계적으로 그 진척도가 매우 초보적인 수준이며 아주 복잡한 X-ray crystallography와 light scattering, 2D-NMR 기술, 특수한 소프트웨어, 그리고 슈퍼컴을 이용하는 초대형 연구과제이므로 이 과제의 연구 대상에서는 제외된다.

본 연구책임자는 요쿠르트 내 다당류 분석에 상당한 연구경험을 갖고 있다. 국내 여러 브랜드의 요쿠르트에 존재하는 세포외 다당류 조성 단당류의 종류와 함량을 GC/MS로 결정하는 연구를 수행하였고, 요쿠르트의 원심분리후 여액속에 함유된 올리고당을 정량하는 연구도 수행한 바 있다.

다당류는 제지, 의료 및 식품산업에서 다양하게 응용된다. 고분자의 다당류는 식품산업에서 경화제, 안정제, 유화제 지방대체제, 또는 겔화제로 사용되는 없어서는 안될 요소로서 2000년 현재 전 세계적으로 년 간 약 70,000톤이 사용되고 있다. 현재 대부분의 산업용 다당류는 식물과 해조류 등에 의존하나, 앞으로 미생물의 세포외 다당류의 사용은 급증할 것으로 전망된다. 유전공학적 개량을 통해 보다 다양한 특징의 다당류를 생산할 수 있기 때문이다 (Cerning and Marshall, 1999). 미생물 유래 다당류에는 잔탄, 덱스트란, 풀루란 및 젤란이 있는데, 특히 잔탄의 경우 산업적으로 많은 양이 생산되어 쓰이고 있는 미생물 다당류중 대표적인 산업화된 다당류이다 (Roller and Dea, 1992; Sutherlands, 1986; Crescenzi, 1995). 유산균의 세포외 다당류(exopolysaccharide, EPS)는 유제품의 경화제와 겔화제로 이미 사용중에 있으며 나아가 정장효과(Gibson and Robertfroid 1995), 콜레스테롤 강하제(Nakajima et al. 1992)또는 면역조절제(Kitazawa et al. 1993; Hosono et al. 1997) 등의 의학적인 기능을 가지고 있는 것으로 보고된 바 있다. 우리나라에서도 미생물에 의한 세포외 다당류에 관한 연구를 수행할 필요성이 매우 높으나 그 기반이 매우 취약한 실정이다.

마침 공동연구자는 신규 유산간균(Lactobacillus spp)을 200여종 분리하고, 이들의 특성을 분석하여 이들 중 가금류의 병원성 미생물(Salmonella enteritidis와 S. gallinarum)에 강한 성장억제 효과(antimicrobial activity)를 보이는 우량균주를 확보하는 연구를 수행하였고 이러한 균주들은 특징적으로 많은 양의 EPS를 생산하는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 이러한 병원성미생물에 대한 항균활성을 갖는 기능성유산균이 생산하는 다당류의 대량생산을 위한 배양의 최적화에 대사공학 기법을 적용하고자 한다. 이 과정에서 연구책임자가 신규 다당류의 분석방법을 개발하고 그 분석자료를 공동연구자에게 제공하는 것이 매우 중요하며 따라서 이 공동연구의 필요성이 절대적인 것이다. 물론 신규 다당류의 분석방법을 개발하는 것 그 자체도 학문적 및 실용적 가치가 매우 높고 필요성이 큰 것이지만 이와 같이 공동연구를 수행함으로써 그 가치가 배가된다고 하겠다.

나. 연구의 필요성

본 연구는 신규 유산균의 세포외 다당류(exopolysacchrides, EPS)의 종합적 분리분석법 개발과 그 활용에 관한 연구이다. 이 연구는 분명히 구분되지만 긴밀하게 상호보완적인 연관성을 갖는 두 분야의 연구자가 짜임새 있게 협력하여 수행하는 연구이다. 연구책임자는 분석화학 연구 전문가로서 신규 다당류의 종합적인 분리분석법을 개발하고 미생물 생물공학 전문가인 공동연구자는 이를 활용하여 신규유산균에 의한 다당류 생산 시스템 개선 및 최적화 연구를 수행한다. 공동연구자가 각 개선 단계에서 보내오는 다당류 시료는 연구책임자가 분석하여 그 분석결과를 공동연구자에게 제공하여 활용하는 견고한 협력시스템 하에서 연구를 진행한다. 다당류의 종합적 분석은 분석화학적인 기반이 약한 공동연구자로서는 감당하기 힘들기 때문에 연구책임자와의 공조연구가 필수적이고, 연구책임자로서는 분석법 개발을 위한 현장시료가 필요한데 공동 연구자가 다양한 시스템 개선 단계마다 그 현장시료를 제공함으로서 학문적 및 실용적 가치가 있는 분석연구를 수행할 수 있다는 큰 이점이 있다. 앞서 언급한 대로 미생물 세포외 다당류에 관한 연구는 그 필요성이 매우 시급하고, 이미 신규 유산균 연구에 경험이 있는 공동연구자가 신규 다당류를 연속적으로 공급하는 가운데 그 분야 분리분석에 경험을 갖추고 첨단 분석방비를 활용하여 수행하는 본 연구에는 시대적인 당위성이 있고 환상적인 학제간 협력연구의 표본을 보여주는 의미가 있다 하겠다. 본 연구책임자는 연구실에 각종 LC, GC/MS, CE, 그리고 CE/MS, LC/MS 등 첨단 분석기기를 보유하고 있다. 비록 본 연구책임자가 대학에 몸담은 지 10년이 넘어서 겨우 이루었으나 최근 CE 및 LC/MS(CE/MS 겸용)를 갖추게 되는 행운을 잡았고 이제 이러한 도전적이고 종합적인 분석연구를 할 여건을 갖추게 되었다. 본 연구책임자가 속한 학과는 500MHz NMR과 MALDI/TOF 질량분석기도 보유하고 있기 때문에 본 연구를 수행하는 데 있어 아무런 걸림돌도 없다.

이 연구의 창의성에 관하여 언급하고자 한다. 우선 분석하려는 다당류가 신규 유산균 및 그 개량균주에 의하여 생산되는 신규 다당류이기 때문에 이에 대하여 연구하는 자체가 이미 독창적이라고 말 할 수 있다.

두 째, 다당류의 분자량 분포 분석에 대한 창의적인 방법을 개발하고자 한다. MALDI/TOF 질량분석기를 사용하는 방법과 GPC/RID 분석법이 알려져 있는데 전자는 정량적 분석의 재현성이 떨어지고 시스템에 따라서 매우 감도가 낮아지는 경우가 있고, 후자는 전반적으로 감도가 낮으며 마이크로컬럼 분석법을 활용할 수 없다는 단점이 있다. 본 연구책임자는 웬만한 시료를 전처리 없이 주입할 수 있는 값싼 일회용 마이크로컬럼을 제조하여 실험에 활용하는 방법을 독보적으로 개발하여 사용하고 있다. 창의적인 방법이란 고가의 범용 GPC 컬럼 대신에 일회성 마이크로 GPC 컬럼을 사용하여 GPC/MS 또는 GPC/UV 분석방법을 개발하자는 것이다. 이 중 GPC/UV 분석법을 위해서는 다당류에 크로모포를 붙이는 반응을 진행시켜야 한다. 일회성 마이크로컬럼을 쓰면 이 반응 후 반응시약을 철저하게 제거할 필요가 없어서 분석과정이 간소화된다. 기존의 방법과 새로 개발한 방법의 분석 결과를 비교하는 것은 매우 좋은 연구가 되리라고 본다.

셋째, 다당류의 구성 단당류 분석에서 기존의 GC/MS 방법 및 음이온교환 이온크로마토그래피 방법과 더불어 CE(capillary electrophoresis)/MS 또는 CEC(capillary electrochromatography)/MS 분석 방법을 도입해 보고자 한다. CE/MS 및 CEC/MS 방법은 다당류의 부분가수분해 산물인 올리고당의 분석에도 활용하여 기존의 NMR 및 GC/MS 분석법과 함께 다당류의 반복단위 규명에 활용하고자 한다.

다. 기대효과

이 연구에서는 이 분야 최고 수준의 기술과 분석장비가 동원되어 우리나라 고유의 신규 유산균 세포외 다당류에 대한 종합적 분석연구가 수행된다. 우리나라 고유의 신규 다당류인 만큼 분석방법과 분석결과 모두 학문적 가치가 큰 것은 당연하며 전 세계 및 우리나라 유산균 다당류 연구에 큰 파급효과를 주리라고 확신한다. 이 연구는 또한 분명히 구분되는 두 연구분야에서 환상적인 협력연구가 주는 연구결과의 상승효과를 홍보할 수 있는 모범적인 경우가 될 것으로 본다. 공동연구자는 이 연구에서 개발하는 개량균주 및 다당류 제조공정에 대하여 산업재산권을 취득하는 것을 목표로 하고 있으며 적당한 기업을 선정하여 산업화할 의향을 갖고 있으므로 우리나라 산업발전과 국가경제에도 기여할 것으로 기대된다.

이 연구에서 다룬 분리정량분석법을 학부실습실험으로 개발하고 본 연구책임자가 담당하고 있는 기기분석 실험 내용에 첨가함으로써, 학부 학생들이 실제 현장시료로부터 주요 함유물에 대한 직접적 분석자료를 얻어보는 값진 경험을 쌓도록 한다. 또한 본 연구실에서 자체 제작한 저가의 일회용 컬럼을 실제 실험에 사용함으로써 실험실습비를 절감하고, 고가의 컬럼을 사용할 때 학생의 부주의에 의한 컬럼의 치명적 손상을 유발할 수도 있는 부담을 원천적으로 배제함으로써, 실험조교와 학생들이 마음놓고 즐겁게 실습을 할 수 있는 분위기를 조성한다.

또한 학부생을 보조 연구원으로 적극 활용함으로써, 산 실험 교육을 수행한다. 이 연구는 일단 분석방법을 개발하면 이후에는 단순 반복하는 실험이 주를 이루게 된다. 이러한 방대한 반복 실험은 대학원생만 활용하여서는 감당하기 힘들다. 따라서 관심 있는 학부생 인력을 십분 활용하여 연구를 수행할 계획이며 이러한 과정을 거쳐서 자연히 학부생을 훈련시키고 대학원 진학을 유도하여 연구인력 양성을 겸하게 될 것이다. 또한 본 연구책임자가 맡고있는 1 학년 학부생의 전공탐색 세미나 과정에서, 선배 학부생들이 연구를 수행하고 있는 실험현장을 보여주는 탐방 코스로 활용하여, 직접적으로도 교육에 활용한다.

석사 및 박사 대학원생은 분석방법 개발 등 연구의 기본줄기를 담당하여 경험을 쌓음으로써 졸업 후 사회에 고급 기술인력으로서 봉사하게 될 것이다. 그리고 석사 졸업생 등을 인턴연구원으로 활용하여 보다 경험이 풍부한 인력으로 양성한다.

2. 연구목표 (Specific Aims)

▆ 작성요령

관련 연구주제가 추구하는 중·장기적인 궁극적 연구목적과 본 과제가 추구하는 최종 연구목표 및 연도별 연구목표를 구체적으로 기술

본 연구주제가 추구하는 중.장기적인 궁극적 연구목적은 우리나라 다당류 관련 연구 및 산업 기반 구축에 기여하는 것이다. 이와 관련하여 본 연구과제가 추구하는 최종연구목표는 모든 다당류연구의 기본이라고 할 수 있는 기능성 다당류의 체계적 분석방법 확립 및 그 활용기반을 구축하는 것으로서 3년에 걸친 연구의 각 해당 년도별 연구목표는 다음과 같다.

1차년도에 연구책임자는 공동연구자에게서 넘어오는 조분리 세포외 다당류를 정제하고 분자량 분포를 구하며 구성 단당류 조성을 분석하는 방법을 개발하고 필요 자료를 획득하여 공동연구자에게 넘겨 그의 연구에 활용하도록 한다. 공동연구자는 신규다당류 생산을 위한 신개념 합성배지 시스템을 구축하고 다당류의 생산에 영향을 미치는 각 요인별로 최적화 조건을 얻는다. 각 단계마다 최적화로 얻어진 다당류 시료는 연구책임자에게 보내어 분석법 개발에 활용하도록 한다.

2차년도에 연구책임자는 다당류 가수분해 산물인 올리고당을 분석하고, 그 자료와 다당류 자체의 분석 자료를 함께 활용하여 다당류의 반복단위를 규명하는 연구를 수행하고 그 연구결과를 공동연구자에게 넘겨 그의 연구에 활용하도록 한다. 공동연구자는 연구책임자에게서 넘어오는 자료를 활용하여 다당류 대량생산 최적화 연구를 수행하고 아울러 균주를 개량하는 기반기술을 확립하여 3차년도 연구에 대비한다.

3차년도에 연구책임자는 2차년도까지 완수한 다당류의 종합적 분석법을 개선하는 동시에 공동연구자에게서 넘어오는 개량균주 별 다당류를 분석하여 자료화하고 공동연구자에게 넘겨 그의 연구에 활용하도록 한다. 공동연구자는 대사공학적 균주 개량과 그 다당류 생산을 지속하여 각 단계 별로 연구책임자에게 시료를 주고 분석결과를 제공받아 연구에 활용하는 방식으로 균주별 EPS 생산 및 기능성 규명 연구를 완수한다.

이러한 3년 간의 완벽한 공조연구를 통하여 우리나라의 취약한 다당류 연구기반을 보강하고 산업화에도 기여하고자 한다.

3. 예비연구내용(Preliminary Studies) 및 자원(Resources)

▆ 작성요령

제안한 연구계획과 관련하여 선행한 예비 연구 데이터가 있을 경우, 관련 내용과 연구에 활용할 수 있는 연구자원(시설 및 장비, 재료, 참여 연구진의 특성 등)에 대하여 기술

본 연구책임자는 분석화학 전문연구자로서 특히 크로마토그래피와 질량분석법을 전공하였으며. 연구실에 각종 LC, GC/MS, CE, 그리고 CE/MS, LC/MS 등 첨단 분석기기를 보유하고 있다. 본 연구책임자가 속한 학과는 500MHz NMR과 MALDI/TOF 질량분석기도 보유하고 있기 때문에 본 연구를 수행하는 데 있어 아무런 걸림돌도 없다.

본 연구책임자는 요쿠르트 내 다당류 분석에 상당한 연구경험을 갖고 있다. 국내 여러 브랜드의 요쿠르트에 존재하는 세포외 다당류 조성 단당류의 종류와 함량을 GC/MS로 결정하는 연구를 수행하였고, 요쿠르트의 원심분리후 여액속에 함유된 올리고당을 정량하는 연구도 수행한 바 있으며, 국내 요쿠르트의 원심분리 여액에는 penta-saccharide 이상의 다당류는 실제로 거의 존재하지 않는 것을 알아냈다. 아래 그림은 국내 한 브랜드의 요쿠르트 여액을 완전가수분해하여 중화 및 건조하고 silylation하여 GC/MS로 분석한 크로마토그램의 예이다. fructose, glucose, galactose 세 성분이 검출되었고, 각 성분 당 여러 이성체가 관찰되었다. Xylose는 internal standard이다.

또 아래 그림은 HPLC와 굴절률검출기를 이용하여 요쿠르트 여액 내 존재하는 일당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 그리고 오당류의 함량을 결정하는 크로마토그램이다. 올리고당 내 당 고리의 수가 같으면 다른 종류의 올리고당이더라도 그 response factor가 거의 같다는 것을 발견하고 이를 이용하여 당 고리수 별로 함량을 정량한 것이다.

Figure 2. The chromatogram of a yogurt sample(Pasteur). The chromatographic conditions are the same as those in Figure 3. The molecular weight of each peak was

determined by LC/MS. 1;water, 2,3; mono-saccharides, 4,5; di-saccharides, 6,7,8,9; tri-saccharides, 10,11;tetra-saccharides, 12,13;penta-saccharides.

또한 공동연구자는 생물공학 전문연구자로서 특히 미생물 생물공학을 전공하였으며, 신규 유산간균(Lactobacillus spp)을 200여종 분리하고, 이들의 특성을 분석하여 이들 중 가금류의 병원성 미생물(Salmonella enteritidis와 S. gallinarum)에 강한 성장억제 효과(antimicrobial activity)를 보이는 우량균주를 확보하는 연구를 수행하였고 이러한 균주들은 특징적으로 많은 양의 EPS를 생산하는 것을 확인하였다. 특히 가금류를 대상으로 수행된 동물임상실험에서는 EPS 생산량이 상대적으로 많은 균주가 월등히 뛰어난 병원균 방어효과가 있음을 확인하였다. 공동연구자의 연구실에도 기본적인 분석장비를 갖추고 있으며 특히 컴퓨터 제어 시스템으로 작동되는 고기능 고용량의 첨단 배양기를 보유하고 있다(아래 그림 참조).

Figure 3. A schematic diagram of continuous cultivation system for Lactobacillus sp.

(A. personal computer, B. spectrophotometer, C. temperature controller, D. pH meter, E. bubble trap, F. pump, G. motor, H. motor controller, I. filter, J. rotameter, K. flow meter, L. pump, M. medium jar, N. fermenter)

4. 연구체계 및 방법 (Research Design and Methods)

▆ 작성요령

연구목표 달성을 위한 연구수행체계·절차·일정 및 연구방법 기술

아래 그림으로 요약되는 연구수행체계와 절차로 연구를 수행할 것이다.

각 연구년도 별로 연구일정과 연구 방법은 다음과 같다.

<제 1차년도>

연구책임자

우선 공동연구자가 기초연구를 통해 얻은 신규 유산균 다당류 시료를 이용하여 다당류의 분자량 분포와 구성 단당류 조성을 분석하는 연구를 먼저 수행한다. 다당류 시료를 정제하는 과정을 먼저 거친다. 우선 물에 녹이고 nonsolvent인 에탄올 또는 프로판올을 서서히 가하여 약간의 침강현상이 보이면 4^oC의 냉장고에 넣어 다당류를 재결정시킨다. 필요하면 이 과정을 반복한다. 이 과정에서 단백질 등 다른 불순물과 저분자량의 다당류가 제거될 것으로 본다. 다음 dialysis 과정을 거쳐 잔류염류를 제거한다. 잔존하는 단백질, 지질 등을 완전하게 제거하기 위하여 Sephadex 컬럼, Superose 컬럼, C18, Silica 및 이온교환 수지 컬럼 등을 거친다. 이러한 일련의 정제과정을 반복적으로 시도하면서 가장 효율적인 정제공정을 확립한다. 순수하게 정제되었는가의 여부는 LC/MS로 확인한다. 정제된 다당류는 진공증류하여 건조시킨다. 건조시료는 NMR로 먼저 분석한다. NMR 분석을 거친 시료는 다시 용매를 제거하여 회수하고 다른 분석에 재사용 할 수 있다. NMR 분석자료는 단위체 결합 패턴을 규명하는 데 활용한다.

분자량 분포를 구하는 것은 기존의 MALDI/TOF 질량분석법 및 GPC/RID 시스템을 이용하는 방법을 시도함과 동시에 본 연구의 독창적인 방법, 즉 일회용 마이크로 GPC 컬럼을 만들어 GPC/MS 또는 GPC/UV로 분석하는 방법을 개발한다. MALDI/TOF로 분석하는 것은 그냥 시료를 MALDI 결정화시약과 함께 건조시켜 질량스펙트럼을 찍으면 되기 때문에 가장 쉬운 작업이나 충분한 감도를 얻기 위해 Na⁺ 등을 첨가해야 할지도 모른다. 어쨋거나 질량스펙트럼(분자량 분포도)이 얻어진다고 해서 그것이 실제 분자량 분포와 일치하는지는 알 수 없기 때문에 다른 방법으로 구한 자료와 반드시 비교해 보아야 한다. GPC 방법으로 분자량 분포를 구하기 위해서는 적절한 calibration curve가 필요하고 넓은 분자량 범위에 대하여 분자량 표준시료가 필요하다. 유산균 다당류 분자량 표준시료는 사실상 구하기 불가능하기 때문에 가장 유사한 탄수화물 표준물, 예를 들면 dextran 등을 대신 사용해야 할 것 같다. 크기가 크고 고가인 범용 GPC 컬럼과 범용 RID 검출기를 이용하여 일차적으로 다당류의 분자량 분포도를 구한다. 다음은 GPC 정지상을 구입하여 일회용 마이크로 GPC 컬럼을 만들고 GPC/UV 분석법으로 다당류 분자량 분포도를 구한다. 이 경우 다당류 시료와 분자량 표준물 모두 크로모포를 붙여서 분석해야 한다. 크로모포 부착시약으로는 2-aminobenzoic acid나 FMOC 등을 시도할 것이다. 이렇게 해서 구한 다당류의 분자량 분포도도 아직 확실하지 않기 때문에 마이크로 컬럼을 비롯하여 GPC 조건은 동등하게 놓고 검출기를 질량분석기로 대치한 GPC/MS 분석법에 의한 분자량 분포도도 구하여 위에서 사용한 다른 방법의 결과와 비교하고자 한다.

다당류 구성 단당류 조성 분석은 황산이나 TFA 등으로 다당류를 완전 가수분해한 후 silylation이나 methylation하고 GC/MS로 분석하는 기존의 방법으로 먼저 정량분석한다. 제 2의 방법으로서 감도좋은 pulsed amperometric detector와 Dionex CarboPac PA-1 컬럼 등이 부착된 음이온교환 이온크로마토그래피를 이용하여 정량분석한다. 정량분석에는 다당류에 존재하는 단당류 성분 모두에 대하여 표준물이 필요하고 또한 다당류에 함유되어 있지 않으면서 함유된 성분들과는 잘 분리되는 internal standard(xylose가 좋은 후보물질임)도 필요하다. 다음은 독창적인 분석방법으로서 CE/MS 또는 CEC/MS 분석법을 개발한다. 단당류들은 분자량과 이동도가 비슷하기 때문에 아무리 CE의 분리효율이 높더라도 분리 안될 수도 있다. 그럴 경우 CE와 LC의 장점을 접합시킨 CEC/MS 분석법으로 개발한다. 즉 실리카 모세관 내부에 amino 결합정지상 등을 채워 넣거나 그러한 리간드를 지닌 고분자 모노리트를 배양시켜서 사용한다.

상기의 연구는 공동연구자가 신개념 합성배지 시스템을 구축하고 본격적인 배지의 요인별 최적화를 시도하는 과정에서 생성되는 다당류의 중요한 변화가 감지되는 단계마다 반복해서 수행한다.

공동연구자

EPS 분리/정제용 신규 단순배지 개발 및 기초적 정제/분석 방법 확립을 목표로 한다. 유산균 배양을 위한 배지는 기본적으로 EPS 생산을 추적하는 실험에서는 MRS 배지를 사용하겠으나, 경제적인 대량배양을 위한 배지 개발을 위하여는 유청(whey) 배지 또는 단순배지를 변형하여 사용하고자 한다. 유산균이 생산하는 EPS는 배지의 탄소원 또는 탄소/질소원 비(C/N ratio)에 영향을 받는 것으로 보고된바 있다 (Breedveld et al., 1993; Cerning et al., 1994; Mozi et al., 1995). 따라서 최적의 배양조건을 확립하기 위하여, 우선 일반적으로 유산균의 균체수 증대를 위해 사용하는 복합배지인 MRS 배지를 대신할 수 있는 단순 화학합성배지를 이용하고자 한다. 이를 위하여 먼저 KLB58의 영양요구성(auxotrophy) 규명이 선행되어야 하며, 이전 보고에서 발표된 유산간균(Lactobacillus spp)을 위한 몇몇 단순배지를 기본적인 배지로 이용하면서 본 연구에서 사용하는 L. paracasei KLB58에 적합한 단순배지를 조성하고자 한다(Grobben et al., 1995; Kimmel and Roberts, 1998). 확립된 단순배지를 이용하여 EPS 생산이 최대가 되는 탄소원과 C/N ratio를 찾고자 한다.

EPS 분리는 에탄올 침전법으로 수행한다. 먼저 균주 배양액 중에 있는 다당류 분해 효소를 불활성화시키기 위해 배양액을 100도에서 15분간 가열한다 (Pham et al., 2000). 세포를 원심분리(16,000 x g 10분)로 제거한 다음, 상등액에 두배의 에탄올을 첨가한후 4도에서 24시간 침전 시킨다. EPS 침출물을 원심분리(16,000 x g 15분)하여 얻은 후 수용액에 현탁한다. EPS 현탁액은 멸균증류수로 수 차례 dialysis하여 단당류를 제거하고, 불용성물질은 원심분리로 제거한 후 재침전시킨다. 조분리된 EPS는 4도에서 동결건조하고, 당 분석은 페놀-황산법으로 수행하여 측정한다 (Dubois et al., 1956).

<2차년도>

연구책임자

공동연구자가 배지최적화 과정에서 다당류의 중요한 변화가 감지하는 단계마다 제 1차년도에서 수행한 분석을 반복하는 업무를 수행하면서, 동시에 다당류의 반복단위 단위체 결합패턴을 규명하는 연구를 수행한다. 이를 위하여는 다당류 자체의 NMR 뿐만 아니라, 다당류를 부분가수분해 하여 생긴 올리고당에 대해서도 NMR 및 GPC/MS, CE/MS 등의 분석을 수행하고, 또 완전가수분해 바로 전 단계 정도로 처리하여 작은 분자량의 올리고당을 구하여 다시 NMR 및 GPC/MS, CE/MS 등의 분석을 한 다음 전 자료를 종합적으로 비교검토 하여야 한다. 물론 다당류 구성 단당류 조성의 정보도 단위체 결합패턴 규명에 중요한 역할을 한다.

아직 신규 유산균의 다당류 분석을 해본 일이 없기 때문에 반복단위가 단일한 것인지 복합적인 것인지 알 수 없으므로 분명하지는 않지만 두 가지 가능성을 모두 고려하여 연구를 수행한다. 한 균주에서는 단일 반복단위이다가 변종에서는 복합적일수도 있고 단일 반복단위인 경우에도 배지조건에 따라 반복단위에 변화가 있을 수 있다. 우선은 다당류의 반복단위가 단일한 경우로 간주하여 실험을 진행한다. 이 경우에는 다당류나 부분가수분해 올리고당의 NMR 스펙트럼의 기본골격이 매우 유사하게 나오며 질량스펙트럼에서도 단일한 반복단위를 뒷받침하는 자료들이 얻어지므로 단일반복단위인가 아닌가 하는 것은 쉽게 판가름할 수 있다. 그렇더라도 반복단위 단위체 결합패턴은 위에서 언급한 모든 분석자료를 종합검토하고 문헌에 알려진 기존자료들과 대조해 가면서 매우 신중하게 결정해야 한다.

다당류의 반복단위가 둘 이상의 복합적인 경우라면 일이 훨씬 확대된다. 이 경우에는 부분가수분해 올리고당에 대하여 각 fraction 별로 분리수집해야 하고 각 fraction에 대하여 NMR 및 GPC/MS, CE/MS 등의 분석을 수행하여 반복단위 단위체 결합패턴을 조사해야 하고 이 작업을 모든 fraction에 대하여 반복해야 한다.

여하튼 어떤 경우에도 그 다당류의 반복단위 단위체 결합패턴을 완전하게 규명하여 공동연구자에게 그 자료를 제공하고 또한 학계에 발표한다.

공동연구자

EPS 생산을 위한 최적 배양조건 확립(fermentation condition)을 목표로 배지조성(최적 탄소/질소원), 산소(통기), 온도, pH이 EPS 생산에 미치는 영향을 정량적으로 연구하고자 한다. 이를 위하여, 유산균의 대량 배양은 회분식 배양을 통해 얻어질 실험결과를 기초로 연속배양이나 유가식 배양방법에 의해 수행될 예정이다. 유가식 배양의 경우 배양시간이 경과되어 EPS 생산이 증가하게 되면서 배양용액의 점도를 포함한 유변학적 물성의 변화를 예상할 수 있다. 특히 생산규모를 확대할 경우, 생산설비의 디자인이나 규격을 결정함에 있어서 제품의 흐름특성은 반드시 파악해야 할 물성 중 하나이다. 따라서 배양액(즉, EPS 수용액)의 유변물성도 측정하고자 한다. 연속배양시에는 낮은 희석속도 범위에서는 희석속도가 증가함에 따라 성장이 증가하지만 최대 성장속도 근처의 높은 희석속도 범위에서는 희석속도가 증가함에 따라 성장이 감소하게 된다. 따라서 중간 희석속도 범위에서 EPS가 최대가 되는 최적 희석속도가 존재할 것으로 기대된다. 본 연구에서는 연속배양시 최고의 생산성(단위시간당 생산되는 EPS의 양)을 나타내는 최적 희석속도를 구할 예정이다.

<제 3차년도>

연구책임자

공동연구자가 각 개량 균주마다 또는 배지최적화 과정에서 다당류의 중요한 변화가 감지하는 단계마다 제 1,2차년도에서 수행한 분석을 반복하는 업무를 수행하면서, 동시에 다당류의 분석법 전반에 대한 개선을 추진하는 연구를 수행한다. 개선할 내용은 실제적으로 상황에 부딪치면서 결정해야 되겠지만 주로 다음과 같은 것들에 주안점을 두고자 한다.

우선 본 과제에서 독창적으로 개발한 일회용 마이크로컬럼을 이용하는 GPC/MS 및 GPC/UV 분석법의 개선이다. 이 방법의 최대 장점은 값싸게 제조한 마이크로컬럼은 원래 몇 번 정도 사용하고 정지상을 털어낸 후 다시 새 정지상으로 충전하여 사용하는 방식으로 쓰도록 되어 있어서 분석 시료가 컬럼에 누적되는 성분 예를 들면 단백질이나 지방산 등을 다소 포함하고 있어도, 즉 시료주입에 의하여 컬럼이 오염될 정도로 시료의 정제가 불완전해도 관계없이 그대로 분석할 수 있어서 시료전처리에 소모되는 많은 시간과 노력을 경감할 수 있다는 것이다. 더우기 GPC/UV 분석법에서 크로모포 부착 반응 후부가시약이 완전히 제거되지 않은 상태에서도 시료를 컬럼에 주입할 수 있다. 개선해야할 내용은 주로 감도 및 분석재현성의 증대로서, 다당류에 쉽고 재현성있게 크로모포를 부착시키는 새로운 크로모포 부착시약의 발견 또는 개발이 그 중심적인 내용이 될 것이다. 또한 GPC/MS에서도 감도가 중요한 역할을 하게 될 것이므로 다당류의 이온화효율과 재현성을 높일 수 있는 이동상 첨가제 등의 개발이 역시 중요한 내용이 될 것이다.

다음 역시 본 과제에서 독창적으로 개발하는 단당류나 올리고당(가수분해 산물)의 CE/MS 및 CEC/MS 분석법 개선이다. 단당류들은 그 분자량과 이동도가 유사할 것으로 기대되므로 일반적인 CE로는 잘 분리가 안될 수도 있는데, 분자량이 같더라도 분자의 구조와 모양이 다소 다르므로 host-guest complex를 이루는 동공내포 분자, 즉 cyclodextrin이나 crown ether 또는 그 유도체 등을 이동상에 첨가하면 단당류마다 complex 생성상수가 다르고 이동속도가 달라지므로 분리효율이 개선될 수 있다. 또한 이들 동공내포 분자를 정지상에 부착시켜 실리카 모세관 내부에 충전시켜서 CEC/MS 형태의 분석법을 개발할 수도 있겠다. CE나 CEC나 소량의 시료를 주입해야 하므로 감도가 문제가 될 수 있다. 따라서 질량분석법의 감도를 증대시킬 수 있는 이동상 첨가제 또는 electrospray 버퍼 첨가제 등을 개발하는 것도 필요할 것이다.

최종적으로 개량 균주 배지별 종합분석결과를 얻고 자료화한다.

공동연구자

EPS 생산 관련 효소 및 유전자 탐색(Genomics and Proteomics) 및 대사공학(Metabolic engineering)을 통한 EPS 생산성 증대를 목표로, 당 대사 관련 주요 효소(합성, 분비, 중합 효소)의 탐색과 효소 발현량 조절에 관한 연구를 진행하고자 한다. EPS 고생산 변이주 개발에 앞서, 유산균이 생산하는 EPS의 생산에 관련한 효소 및 유전자 발굴은 유산균의 genome database상의 염기서열 분석과 기존에 발표된 다당류 합성 유전자와 당 전구체 합성 유전자의 염기서열을 토대로 제작된 시발체(primer)를 이용하여 PCR기법으로 확보하고자 한다. EPS를 생산하지 못하는 돌연변이체 제작은 전통적인 미생물 유전학 방법인 NTG mutagenesis를 이용하여 EPS-minus 돌연변이주를 확보하고, 이를 야생형과 비교하는 실험(comparative proteomics)을 통해 EPS 생산 관련 단백질을 확인하여 위에서 언급한 in silico 결과를 보완하는 실험을 수행하고자 한다. 확보된 관련 유전자는 유산균 vector에 삽입하여 재조합 plasmid를 만든 후, 이를 모 균주에 도입하여 double cross-over homologous recombination에 의한 marker exchange로 knock-out mutant를 제작한다. 각각의 유전자 적중 돌연변이주의 EPS 생산성을 확인한 후 가장 생산성에 영향을 많이 주는 유전자는 과발현 vector에 삽입하여 모균주에 도입하여 해당유전자의 발현량을 증대시켜 EPS 생산성을 높이고자 한다.

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