1. 제 1 세부과제

 기능성 지질로서 선정한 ω-3 다중불포화지방산의 생산량을 극대화하기 위하여, ω-3 다중불포화지방산 생합성에 관련된 효소와 그 유전자를 생물정보학적 기술을 이용하여 동정하고, 이를 바탕으로 대사회로를 분석하고 세포를 재설계하는 방법으로 대사공학기술을 적용하고자 한다. 또한 재설계된 개량종의 최적 생장을 위한 배양공학 기술을 개발하여 상업화하는 것을 목표로 한다. 이 과정에서 축적된 정보와 기술은 본 연구의 중장기 목표인 신규 노화방지 의약품의 개발 및 상품화를 기반기술로 활용하고자 한다.

1.1. 1차년도(2002. 7. - 2003. 6)

(1) 문헌 조사 및 연구 동향 파악

 현재까지 보고되고 조사된 ω-3 PUFA를 생산하는 다양한 생물종 중, 세계 각국에서 현재 활발히 연구되어지고 있는 종들에 대하여 가능한 모든 문헌을 조사하여 그 생산성과 조성에 대한 기본적인 자료를 얻는다. 또한 그 대사작용에 관련된 유전자와 효소들에 대한 관련자료를 얻는다. 이를 기초로 하여 개괄적인 대사회로를 모델링하고 대사공학적 방법으로 향상시킬 수 있는 생산성 증가효과와 생산 단가의 감소효과를 종합적으로 고찰하여 상업화 시 타생산 방법들과 경쟁력을 가질 만큼의 생산성에 대한 목표치를 정한다.

(2) 야생종의 선별

 ω-3 PUFA를 비교적 고농도로 합성하는 것으로 알려진 박테리아, 미세조류, 균류 등에 대하여 현재 활발히 연구 중인 종들을 분양 받아 각각 보고된 최적 배지와 배양조건에서 배양하여 그 최고 세포농도와 생산성 및 조성을 비교하고 대사공학적으로 응용하기 쉬운 종들을 선택한다. 미세조류나 균류는 그 자체로 대사공학적, 유전공학적 접근이 용이하지 않으나 박테리아나 시아노박테리아 등의 경우에는 플라스미드를 이용한 일반적인 방법이 있으며 박테리오파지에 의한 형질도입도 가능할 것으로 예상된다.

(3) 분석 방법의 확립

 실질적으로 목표가 되는 각 효소들과 이를 합성하는 mRNA를 확인하기 위해서는 야생종마다 다른 전기영동과 아미노산 및 염기서열 분석 방법이 필요하고 이를 위해서는 시료의 추출 및 전처리에서부터 데이터의 분석까지 다양한 기술이 필요하다. 또한 대부분의 효소들이 여러 서브유닛과 보조효소들의 복합체이므로 이를 각각 분석하기 위해서는 복잡한 분석 방법과 과정이 필요하게 된다. 각 종들의 생물학적 특성이 다르므로 세포량의 측정방법도 서로 다를 수 있으며 ω-3 PUFA의 총량과 그 조성을 측정하기 위한 추출방법과 GC에 의한 분석방법 등도 필요하다.

(4) 야생종의 ω-3 PUFA 생산에 대한 최적 배양조건의 확립

 본 과제의 최종 목표인 형질전환종, 형질도입종과 야생종의 ω-3 PUFA 생산성 및 그 조성을 비교하기 위해서 먼저 야생종에서의 최대 지질 생산성과 그 조성이 파악되어야 한다. 본 연구진의 축적된 배양공학적 기술을 이용, 초기 배지의 성분, 필수 영양성분의 유가식 배양, pH 및 온도의 조절, 배양기의 선택, 산소 및 이산화탄소의 공급조절, 미세조류의 경우 광도의 조절 등을 통하여 고농도의 세포성장과 높은 ω-3 PUFA의 함량 등의 최대치를 검증한다.

(5) ω-3 PUFA의 생합성에 관계된 효소와 유전자의 동정

 ω-3 PUFA의 합성에 가장 중요한 역할을 하는 효소로 desaturase(Δ9, Δ12, Δ15, Δ6, Δ5, Δ4-desaturase 등)가 있는데 이 효소의 작용은 특정위치의 수소원자 2개를 제거함으로서 이중결합을 만드는 것이다. 현재까지 알려진 바로는 이 효소의 구조 및 특성이 일반적인 효소들과 같이 매우 복잡하며, 그 아미노산 서열이 어느 정도 알려진 것은 Δ9-desaturase 밖에 없는 실정이고 종마다 그 크기와 형태가 다르다. 이 효소가 활성을 나타내기 위해서는 다수의 보조효소와 복합체를 형성해야만 하는 것으로 보고되어 있고 이 효소들을 아미노산 서열 수준에서 확인하기 위해서는 순도 높은 분리방법과 수학적인 예측법이 필요하게 된다. desaturase와 함께 elongase(Δ6, Δ5-elongase) 또한 중요한 효소로서 확인되어야 한다. 또한 배양 중 ω-3 PUFA의 합성이 최대일 때 분리된 mRNA의 조성 및 그 염기서열을 동시에 분석함으로서 좀더 정확한 효소의 아미노산 서열을 알 수 있고 이를 토대로 형질전환과 형질도입에 필요한 벡터를 구성할 수 있게 된다. ω-3 PUFA의 생합성에 관련된 효소들은 대부분 세포질이나 활면소포체에 존재하므로 분리하기에는 용이한 것으로 알려져 있으나 정확한 아미노산 및 염기서열을 얻기는 매우 어려우므로 어느 정도 서열이 밝혀진 Δ9-desaturase의 서열을 토대로 하여 현재 많은 연구가 진행 중인 바이오인포매틱스 기술을 이용할 계획이다.

(6) 해당 효소와 유전자에 대한 구체적인 대사회로의 구축

 아직까지 ω-3 PUFA의 대사회로가 정확하게 정립되지는 않았으나 개괄적인 대사경로는 어느 정도 밝혀져 있다. 이를 토대로 하여 위에서 확인한 효소와 이미 밝혀진 효소들의 반응속도 및 그 가역반응성 등을 고려하여 전체적인 대사회로의 망을 모델링하고 수식화한다. 수식들로부터 시뮬레이션을 수행하여 몇몇 인자들의 작용이 미치는 효과를 예측함으로서 생산성향상을 위한 전략을 수립할 수 있다.

(7) 야생종에 대한 유도 및 저해물질에 의한 대사조절 방법 개발

 수립된 대사회로 모델로부터 효소와 DNA 또는 mRNA 수준에서 작용 가능한 유도 및 저해물질을 확인하고 이를 야생종에 적용한다. 이에 따른 생산성 향상효과와 유도 및 저해물질의 가격 등을 고려하여 그 효율성을 확인한다.

1.2. 2차년도(2003. 7. - 2004. 6)

(1) 야생종의 형질전환에 대한 대사공학적 전략의 선택과 그 방법의 개발

 야생종의 대사회로 모델에서 파악된 대사회로의 중심효소부터 목표로 하여 해당효소의 아미노산 서열 또는 mRNA의 염기서열로부터 cDNA를 시험관 내에서 합성하여 플라스미드 등을 이용, 각 야생종에 대한 가장 효과적인 형질전환 방법을 선택하여 수행한다. 예를 들어 각각의 desaturase를 직접적으로 합성하는 유전자나 다른 대사경로로 가도록 유도하는 효소의 저해물질를 합성하는 유전자 등 많은 경우들을 이용할 수 있을 것이다. 그러나 대사경로에는 단지 하나의 효소만이 작용하는 것이 아니므로 벡터의 구성에는 여러 개의 다양한 효소들의 cDNA가 삽입되어야 할 것으로 생각되고 있다. 이러한 벡터 구성의 기술은 이미 많은 부분 연구되어 있는 분야이므로 벡터를 구성하는 전략과 대사과정 상의 효과를 중심으로 연구와 실험을 수행해 나갈 것이다. 구성된 벡터를 전기충격, 화학적 처리, 유전자 총 등을 이용하여 삽입을 시도하고 발현의 정도를 모델에 근거하여 실험적으로 분석한다.

(2) 숙주 생명체로의 형질도입에 대한 대사공학적 전략의 선택과 그 방법의 개발

 대부분의 ω-3 PUFA 생산종들은 성장속도가 일반종보다 낮고 공학적으로 바람직하지 않은 감속기에서 ω-3 PUFA의 합성이 촉진된다. 이를 극복하기 위하여 전혀 다른 새로운 종에 필요한 효소들을 주입함으로서 매우 높은 생산성을 얻은 예가 다른 유용물질의 생산(PHA, poly-3-hydroxybutyrate, 생분해성 고분자)에서 보고되었다. ω-3 PUFA는 기타 유용물질에 비하여 그 생합성이 복잡하지 않은 편이므로 대장균이나 바실러스와 같은 박테리아와, 효모나 콩과 같은 쌍자엽 식물체로도 형질도입 기술로 ω-3 PUFA의 대량생산이 가능할 것으로 사료되며, 구축된 대사회로 모델로부터 열쇠가 되는 중요효소들이나 그에 관계된 유도 및 저해물질를 합성하는 유전자를 도입하는 등 다양한 대사공학적 시도가 가능하다. 이를 구현하기 위해 각 숙주에 적합한 벡터 시스템을 이용할 수 있으며, 예를 들면 대장균이나 바실러스와 같은 박테리아는 잘 알려진 박테리오파지를 이용할 수 있고, 효모는 pYAC와 같은 벡터를, 쌍자엽 식물은 아그로박테리아를 이용하는 것이 대표적이라 할 수 있다. 본 단계에서는 다양한 숙주 생명체에, 가능한 벡터 시스템을 적용해 가장 우수한 숙주와 벡터 시스템을 선택하게 된다. 뿐만 아니라 각 유전자가 최대로 발현되기 위한 조건들, 즉 이미 알려진 숙주에서의 강력한 프로모터, 발현제어 시스템의 교란 및 회피 등을 고려하여 종합적인 전략을 가지고 수행할 것이다.

(3) 개량종의 순수분리 및 안정성 검증

 대사공학적으로 변환된 어떤 유용한 형질의 종이라 할지라도 항상 야생종으로의 회귀가 일어나기 마련이며, 이는 야생종의 성장속도가 형질전환종이나 형질도입종보다 월등히 높기 때문이다. 이러한 회귀를 막기 위하여 흔히 항생제 내성 유전자를 이용하거나 특정 기질만을 이용가능한 효소를 만드는 유전자를 삽입하는데 이것도 확실한 방법이라 할 수는 없다. 개량종의 순수분리를 위해서는 상당한 기간동안 특정 배지에서 계대하여야만 하고 이를 동정하기 위해서는 합성된 ω-3 PUFA의 함량만으로는 불충분하며 효소 또는 mRNA의 다각적인 분석이 필요하다. 또한 상당한 기간동안 지속적인 표본의 분석으로 개량종의 표현형질 안정성을 수치적으로 검증한다.

(4) 개량종의 ω-3 PUFA 생산성에 대한 최적 배양조건의 개발

 이러한 개량종에 대한 최적 배지 및 그 배양조건은 많은 부분 야생종과는 다를 수가 있다. 그러므로 이에 대한 기초적인 실험이 수행되어야하며 이는 대사회로 모델로부터 예측가능하다. 대사회로는 연구자들에게 필요한 배양인자들, 즉 주요 탄소원, 질소원, pH 및 불포화 반응에 필요한 산소량 등을 정성적으로 뿐만 아니라 수치적으로 예측가능하게 한다. 그러므로 이러한 예측과 실험을 바탕으로 실험을 수행하여 효과적인 최적 배양조건을 개발하고자 한다.

(5) 개량종의 유도 및 저해물질에 의한 대사조절 방법 개발

 최적화된 배양조건이 수립된 후에는 야생종에서 시도되었던 첨가제에 의한 대사조절 가능성을 확인하여야 한다. 이러한 유도, 저해 물질의 효과는 대사회로가 구축되어 있다하더라도 예측이 매우 어렵다. 왜냐하면 보통 이러한 첨가물질의 작용이 세포 내 여러 부분에 광범위하게 일어나는 경우가 많기 때문이다. 그러므로 개량종에서 더 큰 시너지 효과가 있을 수도 있으며 오히려 생산성을 떨어뜨리는 효과가 나타날 수도 있다. 이러한 작용은 확실히 실험적으로 확인할 필요가 있다고 생각된다.

(6) 개량종로부터 ω-3 PUFA의 효과적인 분리 및 정제 방법의 개발

 대사공학적인 접근 중에 매우 큰 분야가 생산물질이 세포 외부로 분비될 수 있게 하는 운반 메커니즘의 구현이다. 이는 어려운 문제로 많은 연구자들이 연구를 거듭하고 있으나 ω-3 PUFA의 경우 알려진 테일링 방법으로 분비 가능하게 하기는 어려울 것으로 예상되나 분비가 가능하게 된다면 그 생산성이 비약적으로 증가하게 되고 또한 배양하면서 동시에 회수도 가능해지므로 분비촉진 연구를 수행할 계획이다. 세포 내에 축적되는 형태라고 한다면 효과적인 세포의 파쇄법이 필요하며 또한 다양한 타물질로부터의 분리 정제 방법도 하나의 연구 부분이 될 것이다.

(7) 야생종과 개량종의 ω-3 PUFA의 생산성 비교 및 개선

 종합적인 측면에서 각 종들을 각각 최적화된 배양조건에서 생산되는 생산물질의 조성 분석, 그 생산수율의 조사, 배지 및 배양 비용의 비교, 분리 및 정제의 비용분석 등을 통하여 초기에 산정한 목표치와 비교하고 실제 대량배양 및 생산공정 시 나타날 수 있는 문제점들을 고려하여 개선될 수 있는 문제점에 대한 추가적인 실험을 수행한다.

(8) 상업화를 위한 중규모 생산에서의 생산성의 비교 및 개선

 대사회로 모델을 기초로 하여 공정적인 수준의 수학적 모델로 확장할 수 있으며 이를 통해 규모의 확대 시 발생할 수 있는 문제점들을 예측한다. 실험실 수준에서의 규모확대 실험을 수행하여 이에 따라 발생할 수 있는 여러 가지 문제들, 예를 들어 배양기 내의 비혼합 영역, 배양기에 따른 교반속도의 효과 및 산소와 이산화탄소의 공급, 규모확대에 따른 생산성 변화 및 종의 안정성 등을 종합적으로 확인한다. 더불어 문제점 발견 시 해결방안을 모색하고 적용시의 결과를 모델로부터 예측하여 상업적인 대량배양시 발생할 수 있는 문제들을 해결할 수 있을 것으로 생각된다.