2. 제 2 세부과제

 노화억제를 위한 천연 항산화제로서 carotenoids를 모델 항산화제로 선정하여 균주개량 및 생산공정과 상품화기술을 개발함으로써 다양한 응용제품을 개발하고자 한다. 동시에 개발된 항산화제를 적용하기 위한 생물학적 기능연구 및 질병 모델계에서의 효능 평가방법을 확립하고, 기존의 항산화제들의 구조적 특징을 분석함으로써 항산화 능력과 관련된 작용기의 특성에 대한 이해를 확대하며, 신규 항산화 의약품개발을 위한 중장기 연구의 기반기술을 확보하는 것을 목표로 연구를 진행하고자 한다.

2.1. 1차년도 (2002. 7. - 2003. 6)

(1) 천연 항산화제의 탐색 및 선정

 현재 사용되고 있는 항산화제의 상용화 가능성 및 특성에 대하여 비교분석하여 모델 천연 항산화제와 생물체를 선정할 예정이다. 우선 미국 FDA로부터 식품 첨가물 및 항산화효과에 대하여 인정받은 β-carotene을 생산하는 균주로서 Blakes trisopora, Phycomyces blakesleanus, Mucorales, Erwinia herbicola, Dunaliella salina, Phaffia rhodozyma 등을 검토할 예정이다. 또한 α-tocopherol보다 지질과산화반응에 1,000배 강력한 저해활성을 나타내는 astaxanthin의 생산균주로는 Mycobacterium lacticola, Brevibacterium 103, Peniopora sp., Phaffia rhodozyma, Haematoccus 등이 연구대상이며, 특히 2000년도에 미국 FDA와 캐나다, 일본 등지에서 양식용 사료 첨가제로 승인을 받은 Haematococcus 균주에 초점을 맞추어 연구를 진행하고자 한다. 이때 단기상품화를 목표로 하는 천연 항산화제는 항산화 효과가 기존제품에 비하여 탁월하여야 하며, 적은 비용으로 생산이 가능하며, 열안정성 등 안정성이 우수해야 하며, 2차대사산물이 생체에 무해하여야 한다.

(2) 최적 배양조건 및 항산화제 생산조건의 결정

 항산화제의 산업적인 생산을 위해서는 고농도 대량 배양이 필수적이며, 이를 위하여 최적 배양조건을 확립하기 위한 연구가 필요하다. 최적 균체성장 조건과 항산화제 생산을 극대화하기 위한 환경조건이 달라질 수 있으므로, 각각에 대한 요인실험(factorial design)을 수행하여 주요 환경인자를 선정하고자 한다. 이때 환경인자로는 빛조건, 영양성분 (C-source, N-source, P-source) 및 농도, 온도, 미량원소(Ca, Fe, Mg, Na, K, trace elements) 등을 선정할 수 있으며, 이를 최적화하는 연구를 추진할 예정이다. 이 결과를 토대로 1단계의 바이오매스 성장용 반응조와 2단계의 항산화제 축적조로 구성된 2단계 생물공정의 각 단계별 최적 운전조건을 도출하고자 한다.

(3) 실험실 규모의 생물반응기의 제작 및 최적 운전조건의 확립

 생물공정 기술을 개발하기 위하여 실험실 규모의 생물반응기(< 10 L)를 설계 제작하고, 이의 효과적인 운전방법을 확립할 예정이다. 생물반응기의 형태는 균체의 특성(크기, 무게, 균체부착정도, shear stress 민감성 등)을 고려하여 교반형, 기포탑 형태, 또는 공기부양식 형태의 생물반응기 중에서 선정하여 제작하고, 운전방법으로는 회분식, 유가식 및 2단계 연속공정을 도입하는 순서로 연구를 진행하고자 한다. 생물공정의 최적화를 위하여 회분식 배양에서는 기본적인 생물반응기의 조업조건(기체유입량, 교반속도 및 방법, pH 및 D.O. 수준 조절 등)을 탐색하고, 유가식 배양에는 조절 영양성분 및 농도 선정, 주입시기를 포함하는 feeding strategy를 개발하며, 2단 연속배양을 위한 균체 분리 및 운송방법에 대한 연구가 필요하다.

(4) 신규 항산화제의 개발을 위한 기반기술 연구

 현재까지 알려진 천연 항산화제 탐색을 위한 재료로는 미생물 대사산물을 비롯하여 버섯류, 조류(algae) 등의 해양생물, 식물, 동물, 식품 가수분해산물 등 매우 다양하며, 발견되는 항산화물질의 종류 또한 대상이 되는 천연물의 종류에 따라 다양하게 알려져 있다. 반면에 항산화 활성을 갖고 있는 물질의 일반적인 특징은 conjugated double bond, phenol 구조, -SH기를 갖는 화합물, alkaloids, 유기산 등으로 알려져 있으며, 특히 β-carotene, canthaxanthin, astaxanthin 및 lycopene 등은 tocopherol보다 강력한 생체 항산화성을 나타내고 있다. 이러한 특징은 carotenoids 특유의 공액 이중결합수와 β-ionone의 화학구조와 깊은 관련이 있는 것으로 추정된다. 따라서 현재까지 알려진 항산화물의 작용기작 및 특정 작용기에 따른 메카니즘 해석, 항산화 효율 등에 관한 깊이있는 연구를 통하여 다양한 종류의 항산화제들을 분류, data-base화함으로써, 이를 토대로 보다 안전하면서도 강력한 항노화제을 개발하기 위한 일반특성을 도출하고자 한다.

2.2. 2차년도(2003. 7. - 2004. 6)

(1) 균주개량 및 생산성 향상 연구

 선정된 생물체의 생산성 향상을 위한 균주개량 방법에는, 전통적으로 화학적 돌연변이 유발에 의한 색소 고생산성 돌연변이주의 개발방법이 있다. 이 방법은 UV, ethyl- methane sulfonate (EMS), NTG에 의한 돌연변이 유발, novozyme sp299 (Novo Nordisk), PEG, CaCl₂를 이용한 원형질체 융합 등의 방법으로 균의 개량을 도모하고 있다. 그러나 이 경우 색소함량이 증가되는 반면 원하지 않는 부위의 유전자 손장으로 인하여 균체성장률이 저조하여 지고 발효배양시 lag time이 길어지는 등 pleiotrophic effect가 심해지는 단점이 발생하게 되며, 색소 고생산성 돌연변이주의 유전학적 불안정성에 기인한 계대 배양에 따라 나타나는 색소 생산성의 퇴화가 돌연변이주의 공통적인 단점인 것으로 지적되고 있다.

 따라서 본 연구에서는 화학적 돌연변이법과 동시에 유전학적 형질전환법에 의한 균주개량을 시도하여 carotenoids 생합성에 관련된 유전자를 증폭하거나 부반응을 block하고 나아가 전반적인 metabolic flux를 carotenoids 생합성으로 집중되도록 대사경로를 변환함으로써 색소 생산성을 증가시킬 수 있는 대사공학 기술의 개발을 시도할 예정이며, 추가로 이 균주의 유전자조작을 통하여 세포벽의 결손 형질주 등 다른 유전적 형질의 개량도 시도하고자 한다.

(2) 파일롯 규모의 생물반응기의 제작 및 운전방법의 개발

 본 연구의 단기 목표가 천연 항산화제의 상품화를 위해서는 천연 항산화제가 고농도로 축적된 바이오매스가 충분하고 안정적으로 공급되어야 한다. 이를 위하여 파일롯 규모의 생물반응기(< 100 L)를 설계 제작하고, 이를 최적 운전하기 위한 연구를 수행할 예정이다. 이때 scale-up 되면서 발생하는 문제, 즉 다른 미생물에의 오염, 온도조절, 효과적인 교반 및 빛에너지의 공급방안을 개선할 필요가 있으며, 대용량의 배양에서 발생하는 물질전달, 열전달, 빛전달에 대한 공학적인 해석을 통하여 scale-up과정에서 배양효율이 떨어지는 문제를 해결할 계획이다. 또한 개발된 생물공정은 선정된 생물체에 국한하지 않고, 보다 광범위한 생물체에 대하여도 적용할 수 있도록 체계적인 운전방법을 개발하고자 한다.

(3) 항산화제의 추출 및 안정화 기술의 확립

 천연 항산화물질의 생산을 위한 일괄 생물공정을 구축하기 위해서는 파일롯 규모의 생물반응기에서 생성된 바이오매스의 분리 회수 방안과 항산화제의 추출방법을 추가하여야 하며, 특히 의약용으로 활용이 가능할 정도의 고순도의 항산제를 생산하기 위해서는 새로운 공법의 개발이 필요하다. 이를 위하여 연속공정을 통하여 지속적으로 공급되는 배양액에 존재하는 균체를 농축 건조하며, 이를 dyno-mill, attrition mill 등의 습식 초미분쇄기를 이용하여 세포벽을 파쇄하고 세포내 물질을 추출하고자 한다. 이 중 천연 항산화제의 선택적 추출을 위하여 acetone을 첨가하여 교반하며, 이를 여과하여 고액분리하고 액상을 진공농축의 과정을 수행하게 된다. 추출 농축된 물질은 이온교환수지가 충진된 column chromatography에서 정제를 수행하고 함량을 측정할 예정이다. 이때 최종적으로 얻어지는 생성물의 천연 항산화제의 함량을 분석하여 추출효율을 향상시키기 위한 추출용매의 양, 추출시간 등을 변화하여 최적시간을 결정하며, 동시에 추출효율, 제조단가, 및 수율을 비교 분석하여 최적의 downstream 공정을 결정할 예정이다.

(4) 항산화제의 상품화 기술 개발

 생산된 항산화 산물의 물리 화학적 안정화를 위하여 ascorbic acid, butylated hydroxy toluene (BHT), tocopherol 등의 항산화물을 첨가하고, 항산화물를 첨가하지 않은 oil을 대조군으로 하여 acid value, peroxide value 등의 변화를 관찰하여 안정화 정도를 검토하는 방법으로 최적의 안정제 선정하고자 한다. 또한 분말화를 통한 생산품의 안정성을 향상시키기 위한 방법으로 적당한 담체를 선정하고 분말화 과정을 거치며, 최종적으로 micro-coating하여 산소접촉을 차단시키는 방법을 추진할 예정이다. 또한 본 연구의 시작품으로 농축 oil과 화장품과 건강식품 형태의 완제품을 제작을 동시에 추진하고자 한다. 농축 oil은 0.5%, 2.5%, 5%, 10% 등의 여러 농도의 oil을 제조할 예정이며, 천연 항산화제가 함유된 노화방지용 기능성화장품으로는 essence나 eye cream 등의 샘플을 제작하고, 건강식품은 천연 항산화제를 주원료로 제작한 분말, tablet, soft capsule 등의 형태로 시작품을 제작하여 상품성에 대하여 검증받고자 한다.

(5) 신규 항산화 의약품 설계기술 개발

 본 연구에서 지속적으로 개발하게 될 항산화제의 고부가 가치 창출을 위하여 항산화제의 생물학적 효능 검정기술 및 항산화 작용기작, 항산화제의 세포신호전달 조절기능, 항산화제의 gene expression에 대한 이해 등의 다방면에 걸친 연구를 진행할 예정이다. 이를 위하여 화학적 돌연변이법과 유전학적 형질전환법에 의하여 개량된 균주에서 생산되는 항산화 물질의 생물학적 효능과 생산량을 야생종과 비교하고, 우성균주만을 선별적으로 계대배양하는 과정을 수행함으로써 우량 균주를 확보하는데 주력할 예정이다. 그리고 개발된 우량 균주를 유전자 수준, 단백질 발현수준, 대사경로상의 flux량 및 항산화 효율을 비교 분석하는 방법으로, 중장기 목표인 새로운 항산화 의약품의 개발과 설계에 필수적인 정보의 확보하는데 주력할 예정이다.